Секвенирование генома для чего делают
Как секвенируют ДНК
Секвенирование ДНК в последние десятилетия превратилось из узкой области, которой занималось небольшое число ученых, в одну из самых стремительно развивающихся технологий. Рост производительности и падение стоимости даже опережают закон Мура, и, из-за большой конкуренции на рынке и огромного спроса, развитие и дальше будет идти высокими темпами. Кроме того, развитие секвенирования привело к такому же буму в биоинформатике и коренным образом изменило биологию, и, постепенно, также основательно меняет медицину.
По катом я подробнее рассказываю, как это делают.
Что такое ДНК
Для начала, чтобы понимать сам процесс, немного необходимой теории.
ДНК — это полимерная цепь, состоящая из мономеров четырех типов, называемых нуклеотидами, последовательность которых и кодирует информацию об организме. Иначе говоря, ДНК можно представить как текст, написанный четырехбуквенным алфавитом. ДНК — молекула, состоящая из двух цепочек, и, хотя, последовательность нуклеотидов у них разная, последовательность одной цепочки можно однозначно восстановить, если известна последовательность другой. Поэтому цепочки называют комплементарными. (англ. Complement – дополнение) Это свойство используется при копировании клетки, когда цепочки ДНК расплетаются, и, на каждой, как на матрице, синтезируется вторая, и каждая из двух дочерних клеток получает свою двуцепочечную ДНК. Вся последовательность ДНК организма называется геномом. Например, геном человека состоит из 46 хромосом.
Несмотря на большое количество разнообразных, как экспериментальных, так и устаревших методов, мейнстримовые коммерческие методы довольно похожи, и, чтобы не делать оговорки каждый раз, сразу скажу, что речь дальше будет идти именно об этих мейнстримовых методах.
Как это выглядит в общем
Перед описанием технологии секвенирования, для интуитивного понимания, проведу следующую аналогию: стопку одинаковых газет взрывают так, что они разлетаются на небольшие кусочки с отрывками текста, а, затем, каждый из этих кусочков читают и, из этих прочтений восстанавливают текст первоначальной газеты.
Чтобы секвенировать ДНК, сначала ее выделяют из исследуемого образца, затем режут на небольшие фрагменты случайным образом, фрагменты называются ридами. От каждого рида оставляют по одной цепочке, и на этой цепочке, как на матрице, синтезируют вторую, причем, тип каждого следующего присоединяющегося нуклеотида как-то детектируют. Таким образом, записывая последовательность присоединившихся нуклеотидов, восстанавливают их последовательность в каждом риде. Затем, из последовательностей ридов с помощью компьютерных программ реконструируют геном.
Важный момент. Суммарная длина ридов должна многократно превышать длину исследуемой ДНК. Делается это потому, что, когда ДНК выделяют из образца, и когда ее режут, часть ее теряется, так что никто не гарантирует, что каждый ее участок попадет хотя бы в один рид. Поэтому, чтобы каждый участок гарантированно был бы прочтен, ДНК берут с большим запасом. Кроме того, при секвенировании возможны ошибки, и, чтобы более надежно прочитать ДНК, каждый ее участок следует прочитать несколько раз.
ДНК разрезают на риды, которые читают, и из них восстанавливают первоначальную последовательность
Такая методика используется не от хорошей жизни. Она добавляет множество трудностей, и, если бы исследователи могли взять и прочитать за раз целую последовательность генома, то они были бы счастливы, однако, это на данный момент невозможно.
У этого есть 2 причины. Первая — это ошибки, происходящие при чтении каждого нуклеотида. Они постепенно накапливаются, и, каждый следующий нуклеотид читается хуже предыдущего, и, в какой-то момент качество чтения настолько снижается, что дальше продолжать процесс бессмысленно. У разных методов секвенирования длина рида, которы они могут хорошо прочитать, составляет порядка десятков или сотен нуклеотидов. Вторая заключается в том, что ДНК — это очень длинная молекула, и, при скрупулезном чтении каждой буквы друг за дружкой, секвенирование заняло бы неприлично много времени, а в данном случае этот процесс легко распараллеливается, и можно одновременно читать миллионы и миллиарды ридов.
Illumina
Такая схема в общих чертах описывает все популярные методики секвенирования. Различаются они лишь методами детекции присоединившихся нуклеотидов при синтезе, и методикой подготовки материала.
На сегодняшний день самым распространенным является метод, который используется в секвенаторах компании Illumina. В этом методе сначала множество различных ридов прикрепляется к стеклянной пластине. Затем, с каждого рида делают множество копий на поверхности пластины так, чтобы на каждом ее небольшом участке располагались лишь одинаковые копии. Это делается для того, чтобы при последующем секвенировании получать сигнал не от одиночной молекулы, а от группы одинаковых молекул, располагающихся рядом. Так и сигнал легче считывать, и надежность считывания увеличивается. Эти молекулы являются одноцепочечными ДНК, и на них в процессе секвенирования синтезируются комплементарные цепи. Реакцию синтеза проводят следующим образом: К началу каждой молекулы присоединяется по одному нуклеотиду. Этот нуклеотид химически блокирован так, что после его присоединения синтез дальше не идет. Кроме того, к нему присоединена метка, которая под действием лазера люминесцирует. Причем, для каждого типа нуклеотидов цвет люминесценции разный. После присоединения нуклеотида пластину освещают лазером и фотокамера фиксирует цвета, которыми люминесцирует пластина. После этого блокировку снимают, метку также снимают, и присоединяют таким же образом следующий нуклеотид. Последовательность световых сигналов на каждом участке пластины в компьютере переводится в последовательность нуклеотидов, и, на выходе получается файл, содержащий последовательности ридов.
Секвенирование по методу Illumina
1 — геномная ДНК 2 — разрезается на риды 3 — к ридам прикрепляются адаптеры, с помощью которых они приклеиваются на 4 — пластину 5 — размножение ридов на пластине 6 — засовывам в секвенатор и 7 — секвенируем
Сборка и аннотирование генома
Если геномы близких организмов раньше не секвенировались, то из ридов, затем, с помощью программ, пытаются собрать единую последовательность нуклеотидов. Риды частично перекрываются, и, с помощью этих перекрытий пытаются выстроить единую последовательность. Здесь есть множество моментов, которые существенно осложняют дело. Например, можно загрязнить образец, и программа будет пытаться выстроить одну последовательность из ДНК разных организмов. Секвенатор может ошибиться при чтении рида, или неверно связать два места в геноме, потому что они очень похожи. На самом деле, сложностей так много, что всех тут не перечислишь. И, некоторые из них настолько сложно поддаются устранению, что, даже геном человека, самый важный и широко исследуемый геном, все еще не секвенирован до конца.
риды и внизу последовательность генома, которая реконструирована на их основе
Когда последовательность генома собрана, то нужно понять, что она значит. На ней находят участки, которые похожи на гены. Делается это следующим образом: В начале и конце генов находятся определенные «метки» из нуклеотидов, и, если на ДНК находят такие последовательности на таком растоянии, что между ними может уместиться ген, то такое место заносится в список потенциальных генов. Затем, этого претендента сравнивают с базой данных уже известных генов других организмов, и, если в ней находят ген, достаточно сильно похожий на этот участок, то ему присваивают функцию этого гена.
Если геном другого организма этого вида уже секвенировался, то его используют, для сборки. Так как геномы разных организмов одного вида различаются лишь незначительно, то для каждого рида находят место на секвенированном геноме, к которому он ближе всего, и на основе этого генома собирают новый.
Секвенирование генома для чего делают
Часть 1. Коротко о секвенировании
Когда делают секвенирование?
Родители особых детей часто смотрят на секвенирование генома или экзома, как на шанс завершить «диагностическую Одиссею». Они надеются выяснить ключевую причину нарушений – от ДЦП, до аутизма. Даже генетический диагноз иногда дает шанс улучшить здоровье ребенка, позволяет скорректировать реабилитацию или планировать будущее семьи.
Секвенирование генома или экзома – это масштабное считывание генетического кода с целью обнаружения в нем мутаций (патогенных вариантов).
Если какие-то из множества найденных мутаций соответствуют клинической картине (видна связь генотип-фенотип), то лаборатория делает предположения о генетическом заболевании.
Конечно, наследственные заболевания диагностируют и без секвенирования – по анализам и по результатам обследования. Особенно, если нарушение хорошо описано. Обычно секвенирование экзома или генома проводят при подозрении на неустановленные генетические заболевания.
Дело в том, что многие внешне одинаковые нарушения могут быть следствием мутаций в десятках различных генов. Особенно при неврологических расстройствах, включая аутизм, эпилепсию, ДЦП, двигательные и сенсорные нарушения, миопатию, умственную отсталость и другие. Они часто становятся диагностической проблемой для врача-генетика.
И наоборот, часто мутации в одном и том же гене могут вызывать различные внешние проявления. Секвенирование может помочь поставить диагноз и в таких сложных случаях.
Секвенирование не позволяет обнаружить крупные изменения в геноме из-за высокой детализации метода. Это связано с самой технологией «нарезки» ДНК на небольшие участки.
Например, если подозреваются крупные хромосомные изменения, то определяют кариотип. Чтобы выявить мелкие хромосомные изменения проводят ХМА (хромосомный микроматричный анализ) или MLPA (Multiplex ligation-dependent probe amplification). Однако эти методы не выявят проблемы на уровне отдельных молекул ДНК.
О разнице хромосомных и моногенных наследственных болезней рассказывается в этом видео.
» >митохондриальные нарушения, которые обычно имеют специфические проявления.
У митохондрий есть собственная ДНК, в которой случаются поломки. Впрочем, митохондриальная дисфункция часто связана с мутациями в ядерной ДНК. Тогда она обнаруживается при секвенировании ДНК ядерных генов. Еще чаще дисфункция бывает вторичной, то есть напрямую не связанной с генетикой.
Побочные находки секвенирования – это распространенные генетические варианты, которые относят к предрасположенностям и факторам риска. Их обычно игнорируют в медицинских отчетах. Но они тоже снижают или изменяют функцию белка, потенциально могут повредить здоровью ребенка и стать причиной неврологических нарушений.
Триггерами таких болезней могут стать: воспаление, стресс, неправильное питание, низкая или чрезмерная физическая активность, токсичные продукты и пр. Особенно высоки риски во время беременности или в раннем возрасте. Регулирование работы генов изучает эпигенетика, которая сейчас быстро развивается.
Что ожидать от результатов?
Медики применяют высокопроизводительное секвенирование (next generation sequencing – NGS) уже более 10 лет. За это время успела накопиться статистика по эффективности метода. В зависимости от типа заболевания и правильного выбора пациента, секвенирование экзома или генома позволяет поставить диагноз редких заболеваний в 30-50% случаев.
Секвенирование все еще не метод первого выбора и не самый дешевый анализ. Тем не менее, секвенирование полнее любых генетических панелей. И секвенирование гораздо надежнее, чем его ближайшая альтернатива – применение микрочипов (CMA).
Объективные ограничения секвенирования в том, что новые гены уже известных заболеваний и многие мутации, вызывающие нарушения, только ожидают своего открытия. Генетические причины более 3000 менделевских наследственных заболеваний, остаются неизвестными. Хотя постепенно они проясняются.
Субъективно диагноз зависит от того, кто и что секвенирует.
Недавно были проанализированы результаты 37 генетических исследований, включающих 20 068 детей. Оказалось, что диагностическая полезность секвенирования генома (WGS) в среднем составляла 41%, а секвенирования экзома (WES) – 36%. В то же время для альтернативного анализа на микрочипах полезность составила лишь 10%.
Более высокая диагностическая ценность была при секвенировании трио (когда его делали сразу ребенок и двое родителей). Интересно, что 36% безрезультатных первоначальных случаев секвенирования экзома были успешно диагностированы при повторном анализе в виде трио.
Диагнозы чаще ставили тем, кто делал секвенирование и получал интерпретацию на базе клиники. В этом случае диагноз был поставлен в 42% случаев, в то время как у обратившихся в стороннюю лабораторию диагностическая ценность составила лишь 29%.
Вероятно, в наших реалиях ценность секвенирования будет у нижней границы диапазона, поскольку родители часто решают сделать анализ самостоятельно.
Как показывает практика, результаты секвенирования могут оставлять для родителей открытыми разные вопросы.
1. Половина работы.
Сейчас такие ситуации редкость, но раньше некоторые лаборатории предоставляли лишь сырые данные секвенирования, без какой-либо клинической интерпретации.
Сам процесс секвенирования (т.е. считывание и упорядочивание генетической информации) полностью автоматизируется.
Зато очень трудоемким считается следующий этап – классификация генетических вариантов с учетом проявлений болезни. Он требует привлечения генетиков или медицинских специалистов.
2. Обезличенность и автоматизация.
Допустим, вместо медицинской лаборатории вы сделали секвенирование экзома в организации, которая занимается «здоровьем, наследственностью, предрасположенностями и персонализированой медициной». Скорее всего вы получите многостраничный, автоматически созданный отчет. В нем вы найдете множество факторов риска, например, развития диабета 2-го типа, облысения, течения туберкулеза, онкозаболеваний… Вместо ключевой проблемы – предположения о моногенном редком заболевании.
Проблема автоматических отчетов – это игнорирование фенотипа (клинических проявлений болезни). Даже если будут использоваться клинические базы данных и будет обнаружен подозрительный редкий вараинт, он может быть выброшен из отчета. Например, алгоритмы могут пропустить малоизученные или “противоречивые” варианты, как недостоверные.
Другой вопрос, может ли предрасположенность быть причиной нарушения у особого ребенка?
Потенциально может. Например, неврологическое нарушение было вторичным и связано с генетически обусловленным риском течения беременности (так оказалось у нас). С генетикой могут быть связаны неврологические осложнения эндокринных, иммунных, инфекционных заболеваний и пр.
Конечно, риски беременности касаются родителей и, хотя они могут быть причиной неврологии ребенка, не обязательно унаследуются. То есть, эти риски могут быть не видны в результатах генетического теста ребенка.
3. Недостаточно данных для специалиста.
Другая проблема – автоматически созданный отчет иногда стараются сделать доступным для понимания широкой аудитории. Особенно при обработке данных на популярных веб-сервисах. Поэтому его упрощают.
Даже если в такой отчет попадет строчка о возможной причине нарушений у ребенка, описание варианта может не содержать важных данных. Это гетерозиготность, качество прочтения, частота аллеля, степень повреждения функции гена, консервативность участка и пр.
Специалисту-генетику, будет недостаточно такого отчета. Но захочет и сможет ли он искать дополнительную информацию в массивах необработанных данных?
4. Медицинский и не более.
Обратная ситуация. Допустим, клинический отчет готовится специалистом, который изучил медицинскую информации о вашем ребенке. Вот пример хорошего клинического отчета. Часто он состоит из заключения (подтверждающего первоначальный диагноз или нет), а также подробной информации для найденной мутации.
Но раз уж была прочитана ДНК многих генов, то кому-то хочется видеть и другую полезную информацию. Зная о предрасположенностях и факторах риска, можно скорректировать диету или выбор лекарств. Например, мы выяснили, почему наш ребенок плохо переносит продукты с высоким содержанием серы и витамина B6, который ему неоднократно пытались ввести. Конечно, данные о предрасположенностях вторичны по отношению к основному диагнозу, но все-таки…
5. Устаревший отчет.
6. Контроль.
Наконец, кто-то хочет самостоятельно разобрать результаты от начала до конца.
Что лучше экзом или геном?
ДНК кодирующих генов, по которым строятся белки, составляет лишь 1.5% генома. Причем она прерывается фрагментами, которые не несут полезной информации. В таком «пунктире» пустые участки называют интронами, а содержащие информацию о гене – экзонами.
Секвенирование экзома означает, что в геноме прочитаны экзоны известных кодирующих белок генов. Мутации в них обычно имеют более серьезные последствия, чем в оставшихся 98% генома. Например, около 85% всех известных генетических менделевских нарушений связаны с регионами ДНК, кодирующими белки.
Поскольку секвенирование экзома дешевле, чем секвенирование всего генома, можно в разы увеличить качество прочтений, без резкого роста затрат.
Тем не менее, услуга «секвенирование экзома» не означает, что действительно будет прочитан весь экзом. Сама технология обогащения ДНК с целью прочитать конкретные участки (гибридизация), приводят к неравномерному покрытию, создавая как «горячие точки» со слишком большим покрытием, так и регионы со слишком низким покрытием (приводя к пропущенным вариантам). Например, не будут секвенированы некоторые экзоны у самых кончиков хромосом.
Также при секвенировании экзома не будут обнаружены какие-то мутации, связанные со структурными изменениями и повторами, при которых сохраняется правильная последовательность ДНК. Например, секвенирование экзома не позволит обнаружить хорею Гентингтона или синдром хрупкой X-хромосомы.
Но из-за малой изученности, интерпретировать влияние вариантов в некодирующей области генома часто гораздо сложнее, чем в кодирующей области. Поэтому для медиков, которые хотят скорее поставить диагноз, решающую роль может играть более простой анализ данных для экзома. И наоборот, секвенирование генома чаще выбирают ученые и исследователи, у которых есть возможности для анализа больших объемов данных.
Как мы уже писали выше, в опубликованном метаобзоре диагностическая полезность секвенирования генома составляла 41%, а секвенирования экзома 36%. Эту разницу стоит учитывать при принятии решения, если нет ресурсных ограничений.
Пока что меньшая стоимость прочтения экзома определяет существенную разницу в цене, несмотря на то, что подготовка образца для экзома обходится дороже. Но стоимость прочтения ДНК с каждым годом становится все дешевле, поэтому когда-нибудь будут секвенировать только весь геном.
Тогда вопрос, «что лучше?» будет снят.
Содержание:
Часть 1. Коротко о секвенировании
1.1. Когда делают секвенирование?
1.2. Что ожидать от результатов?
1.3. Что лучше экзом или геном?
Секвенирование генома
Весь геном человека состоит из более чем трех миллиардов этих нуклеотидов, которые расположены в строго определенной последовательности.
К сожалению, иногда бывает так, что некотоые нуклеотиды исчезают или наоборот удваиваются или заменяются один на другой. Во многих случаях это ведет к неправильному формированию организма. Это может проявляться в виде врожденных пороков или малых аномалий развития, задержке психического развития, аутизме или имеет другие проявления.
Cеквенирование – это тест для определения генетических повреждений (мутаций) в ДНК, которые являются причиной наследственных болезней, наследственных предрасположенностей или особенностией организма.
Полногеномное секвенирование дает максимально полный набор данных о структуре генетического материала и позволяет детально оценить все индивидуальные генетические вариации
Секвенатор нового поколения IlluminaNextSeq 500 применяемый для секвенирования может определять полную структуру генома человека. Каждый участок генома при этом прочитывается 30 раз для повышения точности полученных данных.
Что можно получить при полногеномном секвенировании?
Когда нужно делать секвенирование генома?
В результате полногеномного секвениования получается огромный объем данных который требует специальной обработки. Такая обработка включает несколько этапов:
Секвенирование экзома
Cеквенирование экзома – это тест для определения генетических повреждений (мутаций) в ДНК, которые являются причиной наследственных болезней.
Несмотря на то, что существует более 2000 генетических или менделевских болезней (их наследование подчиняется закону Менделя), вызываемых известными отклонениями в ДНК, многие пациенты, у которых на основании клинических данных предполагается наличие редких генетических заболеваний, часто не проходят молекулярную диагностику.
Общепринятой является точка зрения, согласно которой примерно 85% известных отклонений, вызывающих заболевания, происходят в 1% генома, содержащем экзоны и сплайс-зоны, поэтому исследование этой части генома является эффективным и мощным инструментом клинической диагностики для отдельных пациентов.
Тест предназначен для использования в совокупности с клиническими данными и другими лабораторными исследованиями с целью диагностики редких генетических заболеваний.
Путем исследования в одном тесте практически всех областей генома, кодирующих белки, можно не только заменить потенциальную необходимость во многих дорогостоящих анализах каждого гена, но также резко увеличить шансы на обнаружение вариантов с высоким риском, которые могут в дальнейшем быть подтверждены другими методами как у пациента, так и у его родственников.
Используя разработанный компанией Иллюмина тестовый набор TruSight и секвенатор нового поколения Illumina HiSeq2500, стандартные процедуры, проверенные и реализованные в прошедшем CLIA сертификацию Центре клинической геномики при Калифорнийском университете в Лос-Анджелесе (UCLA), можно в одном тесте получить информацию о 95% кодирующих белковых последовательностях генома из числа всех генов, которые отвечают за появление болезней.
Предназначение этого теста в том, чтобы предоставить полногеномную и исчерпывающую геномную экспертизу, с небольшими затратами и значительно более эффективную, чем последовательный анализ при помощи специальных целевых панелей.
В среднем, для каждого пациента определяется примерно 20 000 вариантов ДНК в экзоме. Однако значительная часть этих ДНК вариантов является доброкачественными полиморфизмами. Чтобы определить потенциально болезнетворные варианты, к данным применяется серия фильтров, специфичных для каждого пациента. В их число входит семейная история, любые дифференциальные диагнозы и все соответствующие компоненты родительских заболеваний. При помощи этого можно провести эффективный поиск всех генов, встречающихся в медицинской литературе или мутационных базах данных, которые по данным врачей отвечают за проявление фенотипов и включают известные варианты ДНК, вызывающие нарушения в белках.
На практике у примерно 50% пациентов обнаруживаются однозначные варианты ДНК, которые являются причиной заболевания. Если однозначных причинных вариантов ДНК не обнаружено, то прочие потенциально вызывающие болезни варианты ДНК сохраняются для возможных будущих перепроверок в будущем, когда будут опубликованы результаты новых исследований.
Также иногда рекомендуется провести дополнительный анализ обнаруженных изменений в ДНК для членов семьи пациента, что может помочь с их дальнейшим анализом и интерпретацией.
Клиническое секвенирование экзома.
Этот тест включает глубокий анализ 4800 клинически значимых генов, которые связаны с известными наследственными заболеваниями. Наличие обнаруженных мутаций подтвержданется классическим секвенированием по Сэнгеру. При необходимости проводится поиск аналогичных мутаций у родителей. Метод клинического секвенирования экзома подходит для обнаружения точечных мутаций, вставок, делеций, инверсий и перестановок в экзоме. Пациент получает заключение об изменениях, связанных с его заболеванием. В то же время лечащий врач может дополнительно запросить более подробную информацию, включая данные о потенциально патогенных вариантах, локализованных в хорошо изученных областях экзома.
Цель теста – полное исследование экзома конкретного пациента. При этом результаты изысканий анализируются и проверяются целой командой специалистов медиков. Кроме того, отчет об обнаруженных изменениях сопровождается подробными комментариями.
Перед проведением тестирования рекомендуется дополнительная консультация врача-генетика. В таком случае пациент может убедиться в необходимости прохождения того или иного набора тестов. Также в ходе консультации рассказывается о возможных преимуществах и рисках генетического тестирования. Дело в том, что потенциальную опасность может представлять не само тестирование (оно совершенно безвредно для пациента), а информация об обнаруженных в генетическом материале отклонениях. В частности, сведения о врожденной предрасположенности к тому или иному заболеванию обычно не сообщаются лицам, не достигшим совершеннолетия. Каждая лаборатория вырабатывает свою политику поведения в подобных случаях.
В качестве исходного материала для тестирования берется свежая кровь. Заморозка или нагрев образцов перед тестированием не допускается, поскольку эти воздействия приводят к разрушению ДНК, что в свою очередь делает результаты исследования недостоверными. Образцы должны поступить в лабораторию течение 48 часов с момента взятия.
Стоит отметить, что полное секвенирование экзома может включать или не включать анализ митохондриальной ДНК. Уточнять возможность данного анализа нужно непосредственно в лаборатории, выполняющей секвенирование. В том случае, если лаборатория проводит митохондриальный анализ, данные по гетероплазмии материнского образца могут не сообщаться.
Вопросы и ответы
Что включает клиническое секвенирование экзома?
Клиническое секвенирование экзома разделяется на несколько этапов.
Секвенирование: Диагностическое секвенирование экзома (DES) включает секвенирование примерно 20 000 генов. Это отличает его от секвенирования всего генома, поскольку метода нацелен на исследование 1-2% областей генома, кодирующих синтез белков, которые предположительно ответственны за появление примерно 85% от числа известных заболеваний. Целью DES является выявление изменений, которые определяют фенотип пациента.
Анализ и проверка: после завершения секвенирования все полученные данные пропускаются через биоинформационный конвейер и последовательно анализируются коллективом медиков. Для каждой обнаруженной альтерации проводится проверка, является ли она связанной с исследуемыми особенностями фенотипа. Потенциально связанные альтерации отправляются на ко-сегрегационный анализ.
Формирование отчета: каждый отдельный случай проходит несколько уровней медицинской проверки, и только после последней из них формируется отчет. Каждый отчет является специфическим для пробанда (человека, генетика которого исследуется) и включает проверку и анализ в том числе литературных данных. Подготовка отчета может длиться от нескольких дней до нескольких недель в зависимости от сложности исследования.
Доступные варианты секвенирования экзома:
Первый уровень (Клиническое секвенирования): Анализ примерно 4 800 клинически охарактеризованных генов. Полное секвенирование экзома пробанда. Проведение ко-сегрегационного анализа семьи для всех положительных или неоднозначных результатов.
Второй уровень (Полное секвенирование экзома): Анализ всех предоставленных генов с целью проведения поиска новых генов (порядка 20 000 генов по всей базе NCBI RefSeq). Полное секвенирование экзома семейного трио. Семейный ко-сегрегационный анализ для обнаруженных позитивных или неоднозначных результатов. Обязательное требование: минимум три образца от членов семьи. Тестирование на образцах эмбрионов не проводится.
Какие данные входят в отчет?
Общие результаты: положительный, предположительно положительный, отрицательный, неоднозначный.
Первичные сведения могут ограничиваться информацией, напрямую связанной с фенотипом. Это помогает выделить наиболее полезную для диагностики болезни информацию. Дополнительные сведения чаще содержат более подробные данные, относящиеся к экзому в целом, безотносительно связи с фенотипом.
Дополнительные сведения: Они варьируются в зависимости от предпочтений и возраста пациента. Данный отчет обсуждается отдельно. В дополнительные сведения попадают только установленные патогенетические или предположительно патогенетические альтерации. О клинически незначимых и доброкачественных альтерациях не сообщается. Дополнительные сведения передаются только пробанду. Прочие члены семьи не получают отчета с дополнительной информацией, однако носительство может быть предположено на основании результатов пробанда.
Когда следует заказывать таргетное секвенирование (целевая панель генов) вместо полного сквенирования экзома?
Перед тем, как начать клиническое секвенирования экзома, важно определить возможность использования таргетных панелей, которые разработаны в отношении некоторой группы заболеваний, например, аутизм, задержка психического развития и пр. К примеру, если в истории семьи обнаруживаются признаки одного или нескольких различных наследственных опухолевых заболеваний, то семья вполне может быть носителем опухолевого наследственного заболевания.
В таком случае более эффективным подходом может оказаться первоначальная проверка при помощи таргетных панелей нового поколения, таких как CancerNext, с целью добиться полного покрытия задействованных генов, поскольку такая проверка позволяет получить в том числе полностью отрицательный результат и исключить наличие мутаций в основных опухолевых генах.
Можно ли комбинировать секвенирование экзома с проведением иных генетических тестов (к примеру, хромосомным микроматричным анализом) в рамках одного заказа?
Мы рекомендуем вначале делать хромосомный микроматричный анализ, а затем выполнять секвенирование экзома.
Что необходимо предоставить для клинического секвенирование экзома?
Для выполнения секвенирования экзома необходимы:
Какова политика сообщения дополнительных результатов тестирования?
В 2013 году Американская общество медицинских генетиков (ACMG) выпустила «Рекомендации по случайным находкам в ходе секвенирования экзома и генома» («Recommendations in Incidental Findings in Clinical Exome and Genome Sequencing»).
В соответствии с рекомендациями ACMG минимальный перечень дополнительных результатов предоставляется по умолчанию для каждого тестирования экзома.
По желанию пациент может отказаться от получения всех дополнительных данных, отметив соответствующий пункт в бланке заявки.
В дополнение к перечисленному, мы можем предостаить возможность получения расширенного отчета о дополнительных результатах. Пациенты, заказавшие клиническую диагностику экзома (DES), могут выбрать один из стандартных вариантов расширенного отчета (получить данные о носительстве рецессивных болезней, предрасположенности к раку, возникающим в детском и зрелом возрасте болезням). Для получения подробной информации требуется заполнить соответствующий бланк заявки на получение дополнительных результатов, детально описывающий подробности заказа.
Информация об обнаруженных альтерациях может не сообщаться в том случае, если для связанного с ними заболевания в настоящее время не существует лечения. К примеру, склонность к раннему возникновению болезни Альцгеймера, в итоговый отчет НЕ включается.
Принимаются ли для тестирования материалы только пробанда, когда образцы родителей или иных родственников первой степени предоставить невозможно (к примеру, для приемных детей)?
Если для тестирования предоставляются только образцы пробанда либо предоставляется менее трех образцов от родственников первой степени, то можно заказать лишь проведение тестирования первого уровня (FTE).
Есть ли у клинического секвенирования экзома технические ограничения?
Да, ограничения существуют.
Можно ли сделать повторный анализ данных, полученных при секвенировании?
Да, мы предоставляем такую возможность.
Можно ли провести полное секвенирование экзома для эмбриональных образцов?
Эмбриональные образцы принимаются только в случае гибели плода. Для эмбриональных образцов доступно тестирование первого уровня (FTE).
Если вариант ДНК был пересмотрен и классифицирован иначе, получит ли врач уведомление об этом, чтобы сообщить обновленную информацию своему пациенту?
Секвенирование экзома в нашей лаборатории предполагает повторную классификацию вариантов. Получение дополнительной информации основанной на больших популяционных исследованиях помогает облегчить интерпретацию и уточнить диагноз. Наша лаборатория, как и все научное сообщество вовлечены в активную работу с целью лучшего понимания человеческого генома. Интерпретации и методы постоянно совершенствуются.
Проверяются ли новые гены?
Новые гены анализируются при условии выбора DES тестирования (клиническая диагностика экзома). Под новыми генами подразумеваются альтерации в генах, которые ранее не связывались с болезнями. В связи со сложностью анализа новых генов, клиническая диагностика экзома (DES) требует больше времени для выполнения заказа по сравнению с тестированием первого уровня экзома (FTE).
Если альтерации в новых генах уже обнаружены и описаны, все усилия направляются на изучение гена, включая координационные исследования и функциональные исследования с группами исследователей, изучающих ген, при наличии таковой возможности.
Предоставляет ли лаборатория полный список вариантов по пациенту?
Да, список предоставляется.
Примечание: не все альтерации из списка вариантов проходят подтверждение другими методами, и потому эти данные должны использоваться лишь в исследовательских целях.
Включает ли проводимое тестирование секвенирование митохондриального генома?
Если было обнаружено, что пациент является носителем мутации (или мутаций), можно ли протестировать членов его семьи?
Да, для членов семьи пациента можно провести односайтовый анализ альтераций, классифицированных как причины болезни.
Родственники первой степени и прочие родственники с тем же фенотипом проверяются в рамках ко-сегрегационного анализа, если соответствующие образцы были получены вместе с образцами пробанда для тестирования.